Группа пневмовирусов - Градиентное центрифугирование

Содержание
Группа пневмовирусов
Номенклатура
Выделение вируса
Хранение вируса
Цитопатогенное действие
Методы повышения инфекционное (тм)
Методы стабилизации инфекционное
Методы определения инфекционности
Гемагглютинация
Гемадсорбция
Иммунофлуоресцентные методы
Твердофазный иммуноферментный анализ
Аналитические методы. Радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация. Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных рсв клетках
Радиоиммуноанализ
Радиоиммунопреципитация
Метод выявления дефектных интерферирующих частиц
Электронная микроскопия
Морфология вирионов
Морфогенез вирионов
Сканирующая электронная микроскопия
Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков
Концентрирование вируса
Очистка и радиоактивное мечение рсв
Градиентное центрифугирование
Очистка рсв методом изопикнического центрифугирования
Радиоактивное мечение вирионной рнк
Анализ вирусных рнк и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле. Анализ белков
Анализ рнк
Очистка матричной рнк для трансляции
Молекулярное клонирование и олигонуклеотидное секвенирование
Очистка вирусных белков. Вирусные полипептиды
Очистка капсидного белка
Очистка вирионных гликопротеинов
Специальные биологические методы. Получение моноклональных антител
Выделение температурно-чувствительных мутантов
Получение персистентно инфицированных клеточных культур
Все страницы

 

Градиентное центрифугирование

В литературе можно встретить не одну методику очистки РСВ градиентным центрифугированием. Представленная ниже была успешно использована для очистки штамма А2.

1. Монослой клеток Нер-2 заражают РСВ. Адсорбцию проводят 2 ч при 37С, затем добавляют культуральную среду.

2. Через 10 ч после заражения добавляют актиномицин D до концентрации 0,3 мкг/мл. Для радиоактивного мечения РНК через 16-20 ч после заражения заменяют культуральную среду на свежую, содержащую 20 мкКи/мл - уридина. Для введения метки в белки в среду добавляют 5 мкКи/мл - метионина.

3. При проявлении ЦПД и образовании синцитиев собирают культуральную жидкость. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием 20 мин при 11000 g и концентрируют вирус центрифугированием 90 мин при 65000 g на холоду.

4. Осадок ресуспендируют в буфере NTE при ультразвуковой обработке.

5. Вирус центрифугируют 1 ч при 150 000 g в 10-50% -ном градиенте концентрации сахарозы и собирают фракции, содержащие видимую зону вируса.

6. Содержащие вирус фракции объединяют, разводят NTE и обрабатывают ультразвуком. Вирус вновь центрифугируют 2 ч при 150 000 g в 20-60% -ном градиенте концентрации сахарозы.

7. Вирус концентрируют повторным центрифугированием 90 мин при 65000 g.

Данная методика позволяет получить частично очищенные препараты радиоактивно меченного РСВ. Для последующей очистки предложены более сложные методы; инфекционность, которая в обычных условиях очень чувствительна к центрифугированию, можно стабилизировать добавлением MgS04 до концентрации 1 М.



 
Баннер












Регистрация доменов

Зарегистрируй себе домен!
Имя:


defin.ru



Конвертер величин


Что конвертируем:сколько:
соответствует:

Посетители

Сейчас 67 гостей онлайн