Группа пневмовирусов - Методы определения инфекционности

Содержание
Группа пневмовирусов
Номенклатура
Выделение вируса
Хранение вируса
Цитопатогенное действие
Методы повышения инфекционное (тм)
Методы стабилизации инфекционное
Методы определения инфекционности
Гемагглютинация
Гемадсорбция
Иммунофлуоресцентные методы
Твердофазный иммуноферментный анализ
Аналитические методы. Радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация. Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных рсв клетках
Радиоиммуноанализ
Радиоиммунопреципитация
Метод выявления дефектных интерферирующих частиц
Электронная микроскопия
Морфология вирионов
Морфогенез вирионов
Сканирующая электронная микроскопия
Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков
Концентрирование вируса
Очистка и радиоактивное мечение рсв
Градиентное центрифугирование
Очистка рсв методом изопикнического центрифугирования
Радиоактивное мечение вирионной рнк
Анализ вирусных рнк и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле. Анализ белков
Анализ рнк
Очистка матричной рнк для трансляции
Молекулярное клонирование и олигонуклеотидное секвенирование
Очистка вирусных белков. Вирусные полипептиды
Очистка капсидного белка
Очистка вирионных гликопротеинов
Специальные биологические методы. Получение моноклональных антител
Выделение температурно-чувствительных мутантов
Получение персистентно инфицированных клеточных культур
Все страницы

 

Методы определения инфекционности

Инфекционность препаратов РСВ можно определить методом бляшек. Метод, описываемый здесь для клеток BS-C-1, пригоден и для работы с большинством других клеточных культур.

1. Высевают по 10 (в 6 степени) клеток в чашки Петри диаметром 60 мм. Чашки инкубируют в течение ночи при 37С и используют клетки сразу же после образования плотного монослоя.

2. Культуральную среду удаляют и вносят в чашки по 0,2 мл последовательных 10-кратных разведений вирусного препарата. Для приготовления разведений можно использовать буферный раствор, например PBS, или, предпочтительно, среду MEM.

Характерное для РСВ ЦПД на монослой клеток MRC-5

Рис. 1. Характерное для РСВ ЦПД на монослой клеток MRC-5

ЦПД на РСВ на монослой клеток BS-C-1

Рис. 2. ЦПД на РСВ на монослой клеток BS-C-1

В обоих случаях используемый для разведения вируса раствор должен содержать 0,5% ЭТС и антибиотики.

3. Культуру инкубируют 1 ч при 31 °С для адсорбции вируса.

4. В каждую чашку вносят по 5 мл покрытия. Удаление инокулята необязательно. В качестве покрытия можно использовать среду MEM, содержащую 1-2% ЭТС, антибиотики и 0,9% агара. Эту среду готовят, смешивая равные объемы нагретой до 37 С среды MEM в двойной концентрации и расплавленного 1,8% -ного агара Нобль. При температуре 43-46 С агар не застывает, и покрытие можно наносить на слой клеток без их повреждения.

5. Клетки инкубируют 3-5 сут. при 31-39С; время инкубации зависит от температуры: чем выше температура, тем короче время инкубации.

Для приготовления стабильных препаратов, в которых можно подсчитывать бляшки через длительное время после опыта, в каждую чашку добавляют 2 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в PBS и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фиксации. Фиксирующий раствор и агаровое покрытие удаляют и добавляют в чашки раствор подходящего красителя, окрашивают в течение 5 мин, затем тщательно промывают водой и сушат. Для максимально точного подсчета бляшек необходим бинокулярный микроскоп с небольшим увеличением. Для окрашивания можно использовать и 0,01%-ный раствор нейтрального красного в PBS или в среде, содержащей 0,9% агара.

Обычно для усиления контраста из состава агарового покрытия исключают феноловый красный, но это не имеет принципиального значения. Окрашивание раствором нейтрального красного проходит быстрее, однако такие препараты нестабильны и подвержены фотохимическому повреждению под действием света.

Окрашивание с помощью твердого нейтрального красного, входящего в состав агарового покрытия, происходит медленнее, однако в тех случаях, когда необходимо выделить инфекционный вирус из индивидуальных бляшек, данный метод явно предпочтительнее.



 












Регистрация доменов

Зарегистрируй себе домен!
Имя:


defin.ru



Конвертер величин


Что конвертируем:сколько:
соответствует:

Посетители

Сейчас 45 гостей онлайн